Halil Ibrahim GULER 1 *, Gizem TATAR 2 , Oktay YILDIZ 3 , Ali Osman BELDUZ 4 , SevgiKOLAYLI 51 Universidad Técnica de Karadeniz, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular y Genética,61080 Trabzon, TURQUÍA2 Universidad Técnica de Karadeniz, Facultad de Medicina, Departamento de Bioestadística y Medicina Informática, 61080 Trabzon, TURQUÍA3 Universidad Técnica de Karadeniz, Facultad de Farmacia, Ciencias Farmacéuticas Básicas, Departamento de Bioquímica, 61080 Trabzon, TURQUÍA4 Universidad Técnica de Karadeniz, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología, 61080 Trabzon, TURQUÍA5 Universidad Técnica de Karadeniz, Facultad de Ciencias, Departamento de Química, 61080 Trabzon,PAVO

Resumen

La carboxipeptidasa relacionada con la enzima convertidora de angiotensina (ECA), ECA-II, es un tipo I de proteína de membrana integral de 805 aminoácidos que contiene una unión de zinc HEXXH-E secuencia de consenso. La ACE-II se ha implicado en la regulación de la función cardíaca y también cómo receptor funcional del coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo(SARS). En este estudio, el potencial de algunos flavonoides presentes en el propóleo para unirse a ACE II receptores se calculó in silico .Constantes de unión de diez flavonoides, ácido cafeico, éster fenetílico del ácido cafeico, crisina. Se midieron galangina, miricetina, rutina, hesperetina, pinocembrina, luteolina y quercetina. utilizando el programa de acoplamiento molecular Auto Dock 4.2. Y también, estas constantes vinculantes se compararon con el ligado de referencia de MLN-4760. Los resultados muestran que la rutina tiene los mejores potenciales de inhibición entre las moléculas estudiadas con alta energía de enlace -8,97 kcal / mol y Ki 0,261 μ M, y le sigue miricetina, éster fenetílico del ácido cafeico, hesperetina y pinocembrina. Sin embargo, la referida molécula tiene una energía de enlace de -7,28 kcal / mol y 4,65 μ M. En conclusión, el alto potencial de flavonoides en extractos de propóleo etanólico para unirse a los receptores ACE II indica que este producto de abeja natural tiene un alto potencial para el tratamiento de Covid-19, pero esto debe ser apoyado por más estudios

Introducción

El propóleo es una mezcla natural que las abejas recolectan de la naturaleza para proteger sus urticarias. Las abejas utilizan propóleo para aislar colmenas, momificar insectos muertos y abejas, y como agente antibacteriano, antiviral, antioxidante y antiinflamatorio para muchos agentes biológicos. El propóleo crudo es una mezcla altamente viscosa, ligeramente soluble en agua y mejor disuelto en etanol al 60-80%. El propóleo ha sido un componente indispensable de la apiterapia durante siglos y recientemente se ha utilizado como aditivo alimentario, o complementario, cómo medicina tradicional y complementaria [1, 2]. Su composición varía según la flora de la región donde se recolecta, pero la mayoría de los ingredientes activos del propóleo comprenden la familia de los polifenoles. Ácidos fenólicos, flavonoides (flavanonas, flavonas, flavonoles, etc.), estilbenos, taninos son los polifenoles activos de propóleo [1, 3] . El propóleo no se consume crudo, sino sus extractos etanólicos y acuosos se consumen ampliamente en diferentes formulaciones. Se ha informado que agentes polifenólicos como ácido gálico, ácido cafeico, ácido protocatechico, crisina, quercetina, rutina, galangina, kaempferol, hesperetina, pinocembrina, pinobanksina, apigenina, luteolina, daidzeína, éster fenílico del ácido cafeico (CAPE) son los polifenoles más activos del propóleo y estos metabolitos secundarios varían dependiendo del propóleo fuente [1, 4, 5] . Los estudios demuestran que los extractos de propóleo tienen un alto efecto inmunomodulador e inhibidor potencial para algunas enzimas clínicamente importantes, como ureasa, xantina oxidasa (XO),acetilcolinesterasa (AChE), α- amilasa, α- glucosidasa [6, 7]. Además, in vivo e in vitro los estudios muestran que los flavonoides, uno de los ingredientes activos del propóleo, tienen un alto potencial de inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) [8, 9, 10]. El SARS-CoV-2 recién descubierto se caracterizó como un coronavirus beta y reconocida como la séptima especie discreta de coronavirus capaz de causar enfermedades humanas, las enfermedades causadas por el virus se denomina oficialmente Enfermedad de Coronavirus 2019 (Covid-19) por la Organización Mundial de la Salud (OMS). La epidemia mundial emergente se extendió rápidamente con 2.246.291 casos confirmados y 152.707 muertes en 213 países, áreas y territorios(Informe de situación de COVID-19 de la OMS, 20 de abril de 2020). Estudios posteriores han demostrado que se ha sugerido que el SARS-CoV-2 reconoce la ECA II humana con más fuerza que el SARS-CoV, aumentando así la capacidad de transmitirse de persona a persona [11]. Por lo tanto, la inhibición de la enzima ACE II es importante para los tratamientos contra estas infecciones víricas causadas por SARS-CoV-2. El objetivo de este estudio fue calcular las constantes de inhibición de algunos flavonoides, uno de los ingredientes activos del propóleo de Anatolia, a la enzima ACE II mediante modelado molecular cómo control positivo (S, S) -2- {1-Carboxi-2- [3- (3,5-Dicloro-Bencil) -3h-Imidazol-4-Yl] -Ácido etilamino} -4-metil-pentanoico (MLN-4760). Analizamos el potencial terapéutico compuesto de extractos de propóleos turcos probados contra ACE-II en los estudios experimentales con en métodos silico . Hasta ahora, hay estudios muy limitados sobre Covid-19 y la mayoría de los investigadores se enfocaron principalmente en casos clínicos. Sin embargo, según el conocimiento de los autores, no se ha realizado ningún estudio sobre inhibición de la ECA-II conocida por estar asociada con Covid-19. Por lo tanto, se deben fomentar nuevas investigaciones sobre Covid-19 y compuestos farmacológicos

Materiales y métodosMateriales

Muestras de propóleo crudo obtenidas por apicultores experimentados en 2018 de la región del Mar Negro

Productos quimicos

Todos los estándares fenólicos para análisis de HPLC de ácido gálico, ácido protocatequico, p -OHácido benzoico, catequina, ácido cafeico, ácido siríngico, epicatequina, ácido p- cumarico, ácido ferúlico, rutina, miricetina, resveratrol, daidzeína, luteolina, ácido t- cinámico, hesperetina, crisina, pinocembrina, éster fenetílico del ácido cafeico (CAPE) se adquirieron de Sigma ChemicalCo. (St Louis, MO, Estados Unidos). Todos los disolventes para usar las fases móviles eran de calidad analítica.

Preparación de extractos de propóleo

Las muestras de propóleo crudo se congelaron a -20 ° C y luego se trituraron hasta convertirlas en polvo. Se utilizó el siguiente método para preparar el extracto de propóleo etanólico: 10 g de crudo en polvo. Se colocó propóleo con 100 mL de etanol al 70% en un matraz de vidrio y se agitó con agitador (Heidolph Promax 2020, Schwabach, Alemania) a temperatura ambiente durante 24 horas y luego filtrado con papel Whatman

Determinación de perfiles fenólicos

En este estudio, se utilizaron diecinueve estándares fenólicos para líquidos, cromatografía de alto rendimiento (HPLC) (Elite La Chrom Hitachi, Japón) con detector UV. La separación fue realizada en una columna con una columna de fase inversa C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 μm; Fortis), ingrediente de sistemas de disolventes A (ácido acético al 2% en agua) y disolvente B (70:30, acetonitrilo / agua),que fue sonicado antes de agitar y desgasificado continuamente por el sistema incorporado de HPLC[12, 13] . El caudal se mantuvo constante a 1 ml / min mediante programación de gradiente, comenzando el flujo de la fase móvil como B (5%) a 3 minutos, aumentando gradualmente (hasta 15, 20, 25,40 y 80% a los 8, 10, 18, 25 y 35 minutos, respectivamente) y disminuyendo al 5% a los 40 minutos antes de dejarlo durante 10 minutos para que se equilibre en la columna. El fenólico estándar. El cromatograma de sustancias se muestra en la Figura

1.Acoplamiento molecular

En el estudio, se detectaron algunos flavonoides en los extractos etanólicos de propóleo y se utilizaron cómo ligadores para los receptores ACE II. La estructura cristalina de un ACE II, la proteína se descargó del sitio web del banco de datos de proteínas. Esta estructura cristalina contiene el estado de unión inhibitoria del dominio de metalo peptidasa extracelular de ACE II con el compuesto MLN-4760. Los pequeños compuestos de flavonoides utilizados en los estudios de acoplamiento se obtuvieron de PubChem como forma SDF y se dibujaron en el software Hyperchem [14] y luego se sometieron a una búsqueda conformacional con optimización geométrica. Posibles modos de acoplamiento entre compuestos y la enzima ACE II se estudiaron utilizando Autodock 4.2 [15] y se empleó el algoritmo genético de Lamarckpara simulaciones de acoplamiento. La cavidad seleccionada es el sitio de unión del inhibidor de referencia MLN-4760 [ ((S, S) -2- {1-Carboxi-2- [3- (3,5-dicloro-bencil) -3H-imidazol-4-YL] -etilamino} -4-ácido metil-pentanoico) ] . Dimensiones de una caja de cuadrícula de 52, 34 y 47 puntos en x, y y z. Las direcciones se establecieron con un espaciado de rejilla de 0,375 Å. El programa se ejecutó durante un total de 100 ejecutando el algoritmo genético. La configuración predeterminada se aplicó para todos los demás parámetros. Cómo resultados del acoplamiento molecular describió la afinidad representada por la puntuación de acoplamiento y la unión de interacción en la proteína diana interesada. La visualización de resultados fue realizado con la ayuda de BIOVIA Discovery Studio 2018 [16]

Resultados y discusión. Composición fenólica del extracto de propóleo

En este estudio, un cromatograma estándar HPLC-UV preparado con diecinueve fenólicos, los estándares que incluyen algunos ácidos fenólicos y flavonoides. Los datos de análisis del extracto etanólico de propóleo realizado según este cromatograma. Aunque los ácidos hidroxibenzoicos y los derivados de catequina del propóleo, la muestra se encontró por debajo de los límites de determinación, se encontró que era rica en hidroxicinámicosácidos y flavonoides. Entre los derivados del ácido hidroxicinámico, el ácido cafeico fenil, el éster es la mayor cantidad de componente fenólico en la muestra y le siguió el ácido cafeico y ácido cinámico. No se pudo detectar ácido ferúlico en la muestra. Entre los flavonoides subclase de flavonoides, se detectó la mayor cantidad de mirisetina y la rutina la siguió. Entre estos tres flavanones estudiados, la crisina es el compuesto más abundante. Siguieron pinosebrin y hesperetina. Una cantidad menor de derivado de flavona de luteolina, fue detectado, mientras que daidzeína no se detecta. De todos los compuestos estudiados, la crisina y pinosembrin se detectaron como flavonoides principales en la muestra de propóleo. Aunque la composición del propóleo varía según la flora de la región donde se encuentran, estos flavonoides también fueron reportados en muestras de propóleos de diferentes países [17,18, 19]. Hay muchos estudios científicos que demuestran que el propóleo, un producto natural de las abejas, es una mezcla muy rica de flavonoides y es un importante agente de apiterapia. El perfil polifenólico de propóleos varía según la flora de la región donde se recolecta, ácido cafeico, CAPE, rutina, quercetina, polifenoles como miricetina, kampherol, hesperetina, galangina son las sustancias activas del propóleo de Anatolia [3, 4, 5, 20, 21] . Barbarić y col. (2011) estudió la composición química de los extractos etanólicos de propóleo y ácido ferúlico determinado, p-ácido cumarico, ácido cafeico, tectocrisina, galangina, pinocembrina, crisina, apigenina,kaempferol, quercetina como compuesto fenólico en Croacia, Bosnia y Herzegovina y propóleos de Macedonia [22] . Se encontraron compuestos principales de muestras de propóleo rojo de Brasilia, como luteolina (1,75 mg / g), naringenina (0,96 mg / g), kaempferol (0,59 mg / g), pinocembrina (0,41mg / g) y biocanina A (0,39 mg / g) [23] . Hay algunas diferencias entre los hallazgos porque la composición química del propóleo varía según la región geográfica, clima, condiciones ambientales y temporadas de recolección [23, 24, 25]. Los hallazgos muestran que el propóleo es una buena fuente de sustancias fenólicas. La literatura afirma que las muestras de propóleo de diferentes orígenes geográficos tienen un buen antioxidante, antimicrobiano, antifúngico y actividad antiviral (virus de la influenza aviar) [26, 27, 28, 29, 30]

Referencias

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